В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопирования, а также качественный и количественный анализ изображений.

Объектами исследования служат живые и мертвые (фиксированные) клетки и ткани, и их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах.

Основным объектом исследования являются гистологические препараты , приготовленные из фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости и др.),отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез . Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты: фиксированные, заключенные в твердую среду и окрашенные.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:

• 1. взятие материала и его фиксация,
• 2. уплотнение материала,
• 3. приготовление срезов,
• 4. окрашивание или контрастирование срезов.

Для световой микроскопии необходим еще один этап -- заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды.

Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.

Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов происходит на специальных приборах -- микротомах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Смотри ссылку - приборы для изготовления срезов .

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. См. форум гистологические методики .

Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин , который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель -- эозин , окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными , а окрашивающиеся основными --базофильными . Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток - окрашиваются базофильно.

Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.

Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.

Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.

Выделяются следующие виды микроскопии:

1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);

2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);

3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);

4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);

5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);

6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;

7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);

8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.

Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.

Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.

Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.

Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.

Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.

Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.

Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

Взятие материала

– кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

Фиксация материала

Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды

(парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.

Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей

После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование

(для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.

Просветление срезов в ксилоле и толуоле

Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

Методы гистологического исследования. Современная гистология имеет широкий арсенал разнообразных методов исследования. Все эти методы объединяет требование применения специального прибора - микроскопа, и поэтому все они микроскопическими методами.

Зависимости от состояния исследуемого объекта эти методы разделяют на гостиной (или Суправитальное), когда изучаются живые клетки, ткани, органы и даже целые организмы, и поствитальни, когда исследуют мертвые фиксированные объекты.

Становление поствитального метода, или метода изготовления постоянного гистологического препарата, происходило параллельно со становлением самой науки гистологии во второй половине XIX в. Его называют еще методом классической гистологии. Этот метод, называется гистологической или микроскопической техники, требует достаточно сложной подготовки объекта исследования. Последняя является предметом для написания специальных, достаточно больших по объему пособий. Студенту, который начинает изучать гистологию, необходимо ознакомиться с основами техники изготовления гистологических препаратов, для того чтобы лучше понять эти препараты и научиться анализировать, "читать", ибо именно постоянные гистологические препараты широко используются как в учебном процессе, так и в научных исследованиях.

Первый этап при изготовлении препарата - получение материала. Уже на этом этапе, как и на всех последующих, следует избегать излишнего травмирования объекта. Поэтому, вырезая кусочек органа или ткани, надо брать острые ножницы или лезвие, не сжимать ткань пинцетом. Кусочки берутся небольших размеров - около 1 см3 (лучше 7x7x3 мм). Материал должен быть свежим, принимать его нужно как можно скорее после забивки экспериментального животного или смерти человека.

Следующий этап - фиксация материала, осуществляется путем погружения взятого кусочка в фиксирующие жидкости. Целью этого этапа является закрепление гистологических структур и макромолекул в том месте и состоянии, в котором они были в живом объекте. Конечно фиксаторы обусловливают определенные изменения прижизненного состояния структур, но можно подбором специальных фиксировали-ных агентов свести эти изменения к минимуму. Фиксаторами служат спирты (этиловый, метиловый), растворы формалина, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Чаще применяются различные сложные фиксирующие смеси, включающие названные компоненты в различных соотношениях.

Третий этап - обезвоживание фиксированного материала. Для этого используют спирты различных концентраций, постепенно возрастают от 50-70 до 100 градусов. Обезвоживание необходимо для следующего этапа - уплотнение объекта, осуществляется в парафине, целоидини, синтетических смолах. Подавляющее большинство этих веществ с водой не смешивается, и поэтому для пропитки ими материала необходимо тщательно удалить воду из ткани, а затем пропитать ее ксилолом (толуолом, бензолом), то есть веществом, хорошо растворяет парафин, а также смешивается со 100-градусным этиловым спиртом. После пропитки объекта жидким парафином при температуре 55-5б ° С ему дают затверднуты при комнатной температуре вместе с парафином в специальных формочках. Так получают парафиновый блок. Эта процедура называется заливкой. Ускоренное уплотнение достигается путем замораживания кусочков ткани сухим льдом (двуокисью углерода) или жидким азотом, однако структура исследуемых гистологических объектов сохраняется в таком случае хуже.

Уплотнение материала позволяет изготовить из него тонкие (толщиной 5-7 мкм), пивтонки (0,5-1 мкм) срезы, используемые для световой микроскопии, для электронной микроскопии используют ультратонкие срезы (0,05-0,2 мкм). Изготовление срезов проводят на специальных приборах-микротомы (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Тонкий, пивтонкий или ультратонкий срезы являются прозрачными для световых лучей или пучка электронов объектами и дают возможность изучения их под соответствующими микроскопами. Для того, чтобы различать структурные детали объекта, большинство которых не имеют естественного контраста, полученный срез надо красить (для изучения под световым микроскопом) или контрастировать (для электронной микроскопии).

В гистологии существует много методов окраски препаратов и применяется много различных красителей зависимости от цели исследования. Гистологические красители по происхождению делятся на растительные, животные и синтетические (анилиновые). Примером растительных красителей является гематоксилин, получаемый из коры кампешевого дерева, растущего в Центральной Америке, а животных кармин, который получают из насекомых - кошенили. Абсолютное большинство красителей являются синтетическими - эозин, фуксин, азур т.д..

Важнейшей является классификация гистологических красителей по химическим свойствам, поскольку на ней основывается ряд понятий и терминов, которые будут встречаться на протяжении всего курса. Итак, по химическим свойствам гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. Свойства кислых красителей оговариваются группами-СООН,-HS03,-Н2Р03, это так называемые анионные красители. Кислые красители окрашивают цитоплазму клетки, их называют цитоплазматическими. Примером таких красителей могут быть эозин (дает ярко-розовый цвет), светлый зеленый (дает зеленый цвет). Гистологические структуры, способные закрашиваться кислыми красителями, называют оксифильных (ацидофильными, эозинофильными). Это, например, цитоплазматические гранулы эозинофильных лейкоцитов, коллагеновые волокна и т.п..

Основные красители являются катионными, подавляющее большинство их в составе молекулы должно положительно заряженные атомы азота. Названы красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. Примером могут служить гематоксилин (красит в сине-фиолетовый цвет), кармин (в светло-красный), сафранин (темно-красный), азур II (в синий). Гистологические структуры, способные закрашиваться основными красителями, называют базофильными. Это гранулы в цитоплазме базофильных лейкоцитов, ядра клеток и т.п..

Нейтральные красители образуются в случае сообщения водных растворов кислого и основного красителей, например, еозиново-кислый метиленовый синий. Кроме того, следует различать нейтральные красящие смеси, когда в растворе одновременно имеются основной и кислый красители. Структуры, которые одновременно воспринимают и основные и кислые красители, называют нейтро профильной-ми, или полихроматофильнимы. Примером могут служить гранулы нейтро профильных лейкоцитов, цитоплазма полихроматофильних эритро-бластов т.д.. Способность гистологических структур менять цвет основного красителя обозначается термином метахромазии. Метахроматические окрашивается зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани и т.д.. Препараты обычно красят, сочетая один кислый и один основной краситель, что позволяет выявить ядро, цитоплазму и все базофильные и оксифильные структуры. Одними из наиболее часто объединяемых красителей является гематоксилин и эозин.

Кроме кислых, основных и нейтральных красителей существуют специальные, используемые для выявления определенных веществ или структур. Например, судан III окрашивает жировые вещества в оранжевый цвет, а орсеином - эластичные волокна в бурый.

Крашеные препараты обычно обезвоживает в спиртах, просвещают в ксилоле и заливая тонким слоем канадского бальзама, накрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама получают постоянный препарат, которым можно пользоваться в течение длительного времени. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротомах, размещают на специальных сеточках, контрастируют солями урана или свинца, просматривают через микроскоп и фотографируют. Полученные микрофотографии являются объектом изучения одновременно с гистологическими препаратами.

Кроме описанных тонких срезов есть еще другие виды гистологических препаратов, которые используют значительно реже, лишь в отдельных случаях. К ним относятся мазки (крови, костного мозга, слюны и т.д.), отпечатки (печени, тимуса, слизистой оболочки мочевого пузыря), пленки (соединительной ткани, плевры, брюшины, мягкой мозговой оболочки), тотальные препараты (зародыши ранних стадий развития, половые клетки).

Гостиные (прижизненные) методы исследования клеток или тканей дают возможность получить информацию о том, как в них происходят процессы жизнедеятельности, проследить движение, разделение, рост, взаимодействие клеток, их реакцию на действие различных факторов. Прижизненные методы исследования - необходимое дополнение к тем данным, которые получены методом классической гистологии о строении клеток, тканей. Прижизненные исследования проводят в живом организме, то есть in vivo. Для исследования живых клеток используют методы поздравительное и Суправитальное окраску. Для этого применяют специальные, не токсичны для живых тканей, красители. При поздравительное окраски краситель вводят в организм живого животного и он избирательно окрашивает определенные клетки. Так исследуют клетки макрофагичнои системы при условии введения трипанового синего или литиевого кармина. Суправиталь-не окраска - это окраска живых клеток, изолированные из организма. Так обнаруживают лизосомы (краситель нейтральный красный), митохондрии (Янус зеленый), ретикулоциты крови (бриллиант-крезиловий синий).

Для поздравительного или Суправитальное, а также поствитального исследований неокрашенные гистологических объектов используют ряд специальных методов световой микроскопии - фазоконтрастну, темнопольову, флуоресцентную.

Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность исследуемых неокрашенные структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещается в конденсор, и так называемой фазовой пластинки, содержащейся в объективе. Такая конструкция оптики светового микроскопа позволяет преобразовывать фазовые изменения света, проходящего через объект, в амплитудные, которые замечает глаз как изменения яркости.